Arbeitsablauf im Labor

Die Bakterien-DNA wird aus einer Milchprobe mittels spezieller Reagenzien extrahiert. Die extrahierte Bakterien-DNA und die PathoProof™ Reagenzien werden zusammen angesetzt. Das Kit beinhaltet vier Real-time PCR Reaktionen für jede Milchprobe. In jeder Reaktion werden drei bakterielle Zielgruppen identifiziert.

Ansprechpartner

Christina Schmitz
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Der PCR-Vorgang startet mit dem ersten Vervielfältigungszyklus (Amplifikation). Der Zyklus wird 40 Mal wiederholt, jedes Mal verdoppelt sich die entsprechende DNA-Sequenz. Die DNA-Menge wird unverzüglich nach jedem Vervielfältigungszyklus gemessen. Hierzu binden sich beigegebene Moleküle an die DNA-Stränge und senden dabei ein Fluoreszenz-Signal aus. Die Stärke des Signals korreliert mit der jeweils vorhandenen DNA Menge.

Der Test identifiziert 15 Haupterreger und Erregergruppen sowie das Beta-Laktamase-Gen bei Staphylokokken. Im Ergebnis-Bericht werden sowohl qualitative als auch quantitative Angaben zu den identifizierten Erregern herausgegeben.

Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR)

Es handelt sich um die zyklische Vervielfältigung von DNA-Molekülen in vitro durch den Einsatz einer hitzestabilen DNA-Polymerase und verschiedener Temperaturen.
Zu Beginn der PCR werden Oligonucleotide als Primer an die zuvor denaturierte Ziel-DNA gelagert. In einem zyklischen Prozess aus Denaturierung (Melt), Primer-Anlagerung (Anneal) und DNA-Synthese (Extend) verdoppelt sich die Zahl der DNA-Stränge einer Zielsequenz, die zwischen zwei Primer-Stellen liegt. In der Abbildung rechts werden drei Zyklen dargestellt. Die Zahl der DNA-Kopien wächst theoretisch exponentiell mit jedem Zyklus. Bei dem PathoProof™-Verfahren werden 40 Zyklen durchgeführt.

Nach 10 Zyklen: 210 ~ 1.000-fache Vervielfältigung
Nach 20 Zyklen: 220 ~ 1.000.000-fache Vervielfältigung
Nach 30 Zyklen: 230 ~ 1.000.000.000-fache Vervielfältigung

Die Schlüsselvariable ist der Schwellenwert (ct-Wert), also derjenige Zyklus, an dem eine bestimmte Fluoreszenz-Signalstärke überschritten wird. Je tiefer der Schwellenwert, in desto weniger Zyklen wurde die Menge DNA erreicht, um das entsprechende Signal auszusenden. Das heißt, desto höher war die Ausgangsmenge DNA und damit die Erregermenge. Während beim Plattenverfahren eine Milchprobe normalerweise für nur einen Haupterreger positiv ist, können beim Mastitis PCR-Test mit dem Kit alle 12 Zielgruppen gleichzeitig identifiziert werden. Jede Reaktion beinhaltet ebenfalls eine interne Kontrolle der Amplifikation für die Verifizierung akzeptabler Reaktionsbedingungen.